Лечение больных миопатией Дюшена

Вступ. Прогресуюча м’язова дистрофія (ПМД) вперше описана Б.Дюшеном у 1868 році під назвою «гіпертрофічний параліч». В 1985 році Кункель в Гарварді виділив і охарактеризував ген дистрофії. Це один з найбільш розповсюджених генетичних дефектів осіб чоловічої статі. Зустрічається захворювання з частотою 1 : 30000. Ген м’язової дистрофії Дюшена (МДД), який контролює синтез дистрофіна, локалізований у короткому плечі Х хромосоми 21-ї пари і є самим довгим геном (2,5 млн. азотистих основ) [1]. Великий розмір гена, можливо, і визначає його вразливість до молекулярних поломок.

Виділяють 3 стадії захворювання:

  1. Преклінічна (від народження до появи перших клінічних симптомів). Характеризується початком дегенеративних змін в м’язах, про що засвідчує високий рівень креатинфосфокінази (КФК) в крові. Клінічні прояви відсутні.
  2. Клінічна стадія (від 5 до 12 років). Виникають і наростають гіпертрофія ікроножних м’язів, гіпотрофія стегон, м’язів тазового і плечового поясів, спини. Формується кіфоз і сколіоз. Діти перестають ходити. В м’язах виявляються масивні дистрофічні зміни, розростання фіброзної тканини. Дуже високий рівень КФК в крові (десятки тисяч при нормі 160).
  3. Термінальна стадія. В цій стадії захворювання хворі прикуті до ліжка, або коляски. Розвивається контрактура суглобів, кіфосколеоз, кардіоміопатія. М’язова тканина заміщена фіброзною. Понижується рівень КФК крові. Тривалість стадії залежить від кількості резистентних м’язів.

На сьогоднішній день існує декілька підходів до лікування хворих на МДД. V.Dubovitz в 90-х роках запропонував використання кортикостероїдів в малих дозах. Однак, подальші багаторічні спостереження за хворими показали не високу ефективність цього підходу. У хворих, як правило, розвивається ожиріння, остеопороз, ломкість кісток [2].

Другим підходом до лікування є трансфекція генів за допомогою мутантних ретро-, або аденовірусів. Цей метод також має  цілий ряд недоліків, які не дають можливості для широкого використання методу. Це перш за все великі розміри гена дистрофіна порівняно з розмірами віруса. Трансфіковані мутантним аденовірусом клітини експресують на своїй поверхні білки віруса і є ціллю для цитотоксичних Т-лімфоцитів. Експресія транс гена з часом “затухає”, що автоматично понижує експресію білків ламінінового і вінкулінового рецепторів. Сам дистрофін має багато ізоформ.  При використанні цього методу необхідно застосовувати імуносупресію (FК-506). Ефект від застосування методу дуже короткотривалий, а сам метод фінансово затратний.

Третім підходом до лікування хворих на МДД є терапія алогенними міобластами. Метою є  “рекапітуляція” ембріогенезу і отримання химерних гетерокаріонів шляхом злиття донорських недиференційованих попередників міоцитів з сателітними клітинами реципієнтів. Метод не потребує використання імуносупресії, фінансово не затратний і не призводить до ускладнень[3].

В зв’язку з цим, вивчення можливості використання цього методу для лікування хворих на МДД є актуальним.

Дослідження проводяться в рамках науково-дослідницької роботи, затвердженої АМН України.

Матеріали та методи

На лікуванні знаходилося 14 хворих на МДД (9 у віці 4-12 років, 5 хворих старше 12 років).  Діагноз підтверджено даними біопсії м’язів, молекулярно-генетичного обстеження, голкової електро-нейроміографії, імуногістохімічним методом. В 9 випадках виявлено делеції у відповідних екзонах  21 хромосоми. У 5 хлопчиків хвороба обумовлена мутацією de novo. У хворих старшої групи мало місце ожиріння 2-3 ступеню, контрактури суглобів. На початку захворювання протягом 2-4 років діти отримували малі дози преднізолону. Перед проведенням лікування за допомогою ембріональних алогенних міобластів хворі не отримували ніякої медикаментозного лікування.

Оцінку фізичного стану хворих проводили за шкалою моторного розвитку, запропонованою K.Nair з співавт., 2001 [4 ].

Всім хворим в м’язи верхніх та нижніх кінцівок введено 400х106 ембріональних алогенних міобластів 8-9 тижнів гестації. Результати лікування оцінювали через 12 місяців.

Суспензію міобластів ембріонів людини отримували в лабораторії молекулярної біохімії Інститута нейрохірургії ім..акад. А.П.Ромоданова згідно [5].

Результати
Рис.1. М’язове волокно ембріона людини 9 тижнів гестації в культурі. 7 діб культивування. Фібробласти і клітини-сателіти формують зону росту по периферії  м’язового волокна. Гематоксилін-еозин. 40 х 10.

Ембріональна м’язова тканина відрізняється від м’язової тканини дорослого великим вмістом клітин-сателітів. В організмі дорослих людей ядра сателітних клітин складають 2-7% від загальної кількості ядер м’язів нижніх кінцівок. В   ембріональні м’язовій тканині ця величина складає 30% і більше. Сателітні клітини мають розміри близькі до розмірів клітинних ядер м’язових волокон і знаходяться на периферії між сарколемою і базальною мембраною. Вони зберігають здатність до поділу на протязі всього життя організмів і є резервом для відновлення  м’язової тканини. Пошкодження м’язових волокон приводить до активації клітин-сателітів, які, вступаючи в цикл поділу, зливаються між собою, відновлюючи пошкоджені волокна. Виходячи з стану спокою, сателітні клітини починають експресувати міогенні маркери, тобто активуються гени, які характерні для міобластів (міогенін, МуоD та інші). В процесі регенерації пошкоджених скелетних м’язів сателітні клітини зливаються з існуючими м’язовими волокнами і між собою, утворюючи нові волокна. Відомо що ці клітини здатні мігрувати до пошкоджених волокон завдяки хемотаксису [6].

Рис 2. Оцінка фізичного стану хворих за шкалою моторного розвитку до та через 1 рік після лікування.В культурі м’язової тканини ембріонів людини 9 тижнів гестації (рис.1) зона росту навколо м’язових волокон формується по його периферії. Великі фібробластоподібні клітини з відростками розпластані по субстрату, формуючи клітинну підложку. В верхньому шарі розташовані мілкі клітини з оптично щільними ядрами. Це – клітини-сателіти. Формування зони росту відбувається на протязі 5-7 діб культивування.

Таким чином, ембріональна м’язова тканина має великий регенераторний потенціал, який можна використати в клінічній практиці при лікуванні міопатій.


Рис 3. Зміни М-відповіді м’язів хворих на МДД під впливом лікування

Вивчення ступеня моторних порушень хворих проводили за Загальною Шкалою Моторики [4] до лікування та через 1 рік. Погіршення стану та ускладнень не було. Аналіз результатів засвідчив, що позитивна динаміка мала місце у всіх хворих (рис.2). У дітей молодшої вікової групи збільшився об’єм активних рухів в суглобах, наросла сила м’язів, покращилася осанка. У хворих старшої групи покращення було лімітоване контрактурами в суглобах.

По даним голкової міографії сила скорочень  м’язів верхніх кінцівок збільшилась на 8-14%, амплітуда М-відповіді- на 900-1600 мкВ, в нижніх кінцівках достовірних змін не виявлено (рис.3).

Рис.4 Зміни рівня креатинфосфокінази  в крові хворих на МДД.Рівень креатинфосфокінази в крові  всіх хворих І групи понизився на 70%-280%. В ІІ групі рівень ферменту практично не змінився (рис.4).

Таким чином, важливою передумовою успіху клітинної терапії у хворих на МДД є стадія захворювання. У пацієнтів на заключній стадії міодистрофічний процес вже закінчений і  м’язова тканина в кінцівках майже відсутня. Тому біологічні передумови для успіху клітинної терапії в цей період мінімальні. Найбільш ефективне використання методу в період клінічної та перед клінічної стадій.  

Список літератури:
  1. Гринио Л.П. Дюшенновская миодистрофия // Изд. НМГА., 1998 – 190 с.
  2. Dubovitz V. Management of childhood neuromuscular disorders.// Neuromuscular Disorders.- Vol.16., suppl.1.-2006.- [Abstr. of the XIth International Congress on Neuromuscular Diseases, 2-7 July 2006, Istambul, Turkey].- p. 97.
  3. Skuk D., Goulet M., Roy B. et al. Local expression of donor-derived dystrophin after intramuscular injections of normal muscle-precursor cells in Dushenne muscular dystrophy patients.// Neuromuscular Disorders.- Vol.16., suppl.1.-2006.- [Abstr. of the XIth International Congress on Neuromuscular Diseases, 2-7 July 2006, Istambul, Turkey].- p.185 .
  4. Nair K., Vasanth A., Gourie-Devi M. et al. Disabilities in children with Dushenne muscular dystrophy: a profile// J.Rehabil.Med.-2001.- vol.33.- p.147-149.
  5. Bonavaud S., Agbulut O., D’Honneur G., Nizard R., Mouly V., Butler-Browne G. Preparation of isolated human muscle fibers: a technical report // In Vitro Cell Dev Biol Anim. – 2002. – v. 38. – № 6. – p.66-72.
  6. Kauhanen S., Salmi A., von Boguslawski K., Asko-Seljavaara S., Leivo I. Satellite cell proliferation, reinnervation and revascularization in human free microvascular muscle flaps // J. Surg Res. – 2003. – v.115. – № 2. – p.191-199.